Apostila Definitiva, Parte 2:
Equilibração e Validação Científica no COARACI

Objetivo

Conduzir o protocolo de equilibração de 6 etapas para levar o sistema a um estado termodinamicamente estável e, em seguida, validar rigorosamente esse equilíbrio para garantir que o sistema está pronto para as simulações de produção.

Ponto de Partida

A etapa step6.0_minimization foi concluída com sucesso. O ficheiro de saída step6.0_minimization.gro existe no seu diretório gromacs.

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Módulo 1: A Cascata de Equilibração (Etapas 6.1 a 6.6)

Justificativa: O sistema, embora minimizado, ainda não está na temperatura e pressão corretas. O protocolo de equilibração em múltiplas etapas, gerado pelo CHARMM-GUI, é uma prática recomendada para sistemas complexos como o seu. Ele introduz a temperatura e a pressão de forma gradual, ao mesmo tempo que relaxa lentamente as restrições de posição sobre o fármaco e os lípidos. Este processo de "libertação gradual" permite que os diferentes componentes do sistema (fármaco, membrana e água) se adaptem uns aos outros de forma suave, prevenindo instabilidades e garantindo um estado de equilíbrio fisicamente realista.

Passo 1.1: Preparar e Executar a Etapa 6.1 (Primeira Equilibração)

1. Navegue para o diretório de trabalho, se ainda não estiver lá:

   cd ~/charmm-gui-5452406265/gromacs/

2. Crie o script de submissão para a Etapa 6.1. Este script será o nosso modelo para as etapas seguintes.

   nano job_step6_1.sh

3. Cole o seguinte conteúdo. Este é o script validado que construímos juntos, agora com a entrada correta.

   #!/bin/bash
   #SBATCH --job-name=step6.1_equil
   #SBATCH --partition=gpu-x
   #SBATCH --nodes=1
   #SBATCH --gpus=1
   #SBATCH --ntasks-per-node=16
   #SBATCH --time=04:00:00
   #SBATCH -o step6.1_equil.o%j
   #SBATCH -e step6.1_equil.e%j
   
   # --- CONFIGURAÇÃO DO AMBIENTE ---
   module purge
   module load gnu12/12.2.0
   module load openmpi4/4.1.4
   module load gromacs/2024.3-gcc-12.2.0-j2oyu5l
   
   # --- EXECUÇÃO DA SIMULAÇÃO ---
   cd $SLURM_SUBMIT_DIR
   
   GMX_EXEC="/opt/spack/opt/spack/linux-oracle8-zen2/gcc-12.2.0/gromacs-2024.3-j2oyu5lp64p4eljyelewx6tgb25exhwp/bin/gmx_mpi"
   
   STEP_NAME="step6_1_equilibration"
   INPUT_GRO="step6.0_minimization.gro" # INPUT CORRETO
   TPR_OUT="${STEP_NAME}.tpr"
   
   echo "== Executando grompp para a Etapa 6.1... =="
   ${GMX_EXEC} grompp -f ${STEP_NAME}.mdp -c ${INPUT_GRO} -r ${INPUT_GRO} -p ../topol.top -o ${TPR_OUT} -maxwarn 1 -n index.ndx
   
   echo "== Executando mdrun para a Etapa 6.1... =="
   srun ${GMX_EXEC} mdrun -v -deffnm ${STEP_NAME} -nb gpu -pme gpu
   
   echo "== Job concluído em: $(date) =="
   

4. Salve o ficheiro e submeta-o ao cluster:

   sbatch job_step6_1.sh

Passo 1.2: Executar as Etapas 6.2 a 6.6 (O Padrão Repetitivo)

O processo agora é um ciclo de "copiar, editar, submeter".

• Para a Etapa 6.2:
  1. Copie: cp job_step6_1.sh job_step6_2.sh
  2. Edite job_step6_2.sh:
     • Altere #SBATCH --job-name para step6.2_equil.
     • Altere STEP_NAME para step6_2_equilibration.
     • Altere INPUT_GRO para step6_1_equilibration.gro.
  3. Submeta: sbatch job_step6_2.sh.
• Continue este padrão até à Etapa 6.6, que terá como input INPUT_GRO="step6_5_equilibration.gro".

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Módulo 2: Validação Científica do Equilíbrio (Pré-Produção)

Justificativa: Antes de investir centenas ou milhares de horas de CPU nas simulações de produção, é absolutamente essencial verificar se o sistema atingiu um estado de equilíbrio estável. Uma simulação de produção iniciada a partir de um sistema não equilibrado irá produzir resultados cientificamente inválidos. Esta fase é o seu controlo de qualidade final.

Ficheiro Principal de Análise: step6_6_equilibration.edr (o ficheiro de energia da sua última etapa).

Passo 2.1: Análise das Propriedades Termodinâmicas

• Objetivo: Confirmar que o sistema está em equilíbrio térmico e de pressão com o seu ambiente.
• Comandos (execute no terminal do COARACI):

  # Comando para a Temperatura
  gmx energy -f step6_6_equilibration.edr -o temperature_final.xvg
  # (Escolha 'Temperature' e depois '0')
  
  # Comando para a Pressão
  gmx energy -f step6_6_equilibration.edr -o pressure_final.xvg
  # (Escolha 'Pressure' e depois '0')

• Critério de Sucesso: Após visualizar os ficheiros .xvg no seu computador, os gráficos devem mostrar flutuações estáveis em torno de um valor médio, sem tendências de subida ou descida. A temperatura deve flutuar em torno de 303.15 K e a pressão em torno de 1 bar.

Passo 2.2: Análise das Propriedades Estruturais

• Objetivo: Confirmar que os componentes principais do sistema (a membrana e o fármaco) atingiram uma estrutura estável.
• Comandos:

  1. Área por Lípido (APL) - A verificação mais importante para membranas:

     gmx energy -f step6_6_equilibration.edr -o box_xy_final.xvg

     • (Escolha Box-X e Box-Y e depois 0)
     Justificativa: A APL é uma propriedade fundamental que define a fase da membrana. Um valor estável e correto significa que a sua membrana está fisicamente realista. Para o campo de força CHARMM36 e lípidos POPC, este valor deve estar na faixa de 64-68 Ų.

  2. RMSD (Desvio Quadrático Médio) do Fármaco:

     gmx rms -s step6_6_equilibration.tpr -f step6_6_equilibration.xtc -o rmsd_lig.xvg -tu ns

     • (Escolha o grupo do seu fármaco, SOLU, para o ajuste e para o cálculo)
     Justificativa: O RMSD mede a estabilidade conformacional do seu fármaco. Se o gráfico atingir um platô, significa que a molécula não está a sofrer alterações drásticas e encontrou uma pose estável no ambiente aquoso.

Passo 2.3: Inspeção Visual da Trajetória

• Objetivo: Realizar um "teste de sanidade" final para detetar visualmente quaisquer problemas que as análises numéricas possam não ter captado.
• Ação: Transfira os ficheiros step6_6_equilibration.gro e step6_6_equilibration.xtc para o seu computador local e visualize a trajetória num programa como o VMD ou PyMOL.
• Justificativa: A inspeção visual é a forma mais rápida de garantir que a estrutura geral do sistema faz sentido. Verifique se a membrana está intacta, se o fármaco se comporta de forma razoável e se não há artefactos óbvios da simulação.

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Conclusão

Se todas as suas análises de validação forem bem-sucedidas — temperatura e pressão estáveis, APL num valor correto e estável, RMSD do fármaco estabilizado e uma trajetória visualmente correta — você pode ter alta confiança científica de que o seu sistema está pronto para a produção.